高通量組織研磨儀對真菌分子的破壁和真菌DNA的提取
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
對真菌細(xì)胞進(jìn)行破壁,提取其DNA。
實(shí)驗(yàn)原理
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展,PCR相關(guān)方法越來越多地被應(yīng)用到真菌學(xué)研究中來,而真菌DNA的提取是包括分子診斷在內(nèi)的所有實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ),簡便快捷地提取真菌DNA,且獲得的DNA完整、純度高,對真菌分子生物學(xué)的研究有及其重要的意義。
真菌細(xì)胞壁以幾丁質(zhì)、葡萄糖為主構(gòu)成細(xì)胞壁骨架,而基質(zhì)則由多糖、甘露聚糖、糖蛋白、脂質(zhì)等填充。絲狀真菌堅(jiān)韌厚壁的構(gòu)成,需要較為繁瑣的破壁手段,故真菌DNA的提取較細(xì)菌或其他組織細(xì)胞難度更大。為保證真菌PCR技術(shù)及其相關(guān)分子生物學(xué)技術(shù)的順利開展,簡便快捷地提取真菌DNA,且獲得的DNA完整、純度高,是必須解決的前提條件。
實(shí)驗(yàn)材料和器具
樣品:真菌類
儀器:高通量組織研磨儀(上海凈信,Tissuelyser-48)
耗材:離心管(上海凈信,0.4研磨單位),研磨珠(上海凈信,6號,1顆)
試劑:TE Buffer,DA Buffer,E Binding Buffer,Elution Buffer
實(shí)驗(yàn)步驟
方法1
1.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中,加0.08mlTE Buffer,加入石英砂100mg;
1.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中,設(shè)置頻率13單位振頻,研磨10min;
1.3 取出離心管于65°C環(huán)境中溫浴30min,然后移出;
1.4 加入0.65mlDA Buffer,混合均勻后于冰浴中放置5min;
1.5 放入離心機(jī)14000r/min離心3min;
1.6 將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的0.5研磨單位離心管中,加0.15ml的E Binding Buffer,并混合均勻,將混合液體轉(zhuǎn)移至Spin column;
1.7 放入離心機(jī)6000r/min離心1min,棄去接液管中液體;
1.8 Spin column中加入0.12ml的Wash Buffer,于10000r/min離心30s,棄去接液管中液體;
1.9 重復(fù)步驟1.8,棄去接液管中液體后,再10000r/min離心60s,Spin column轉(zhuǎn)到新的EP管中;
1.10 Spin column中加入0.03ml Elution Buffer,室溫放置1min。12000 r/min離心60s,并棄去Spin column。
方法2
2.1 取0.1g菌絲加入0.4研磨單位離心管中,加0.08ml10×TE Buffer,加入石英砂100mg;
2.2 將離心管放入上海凈信科技的高通量組織研磨儀Tissuelyser-48中,設(shè)置頻率60hz,研磨2-3min;
2.3 加入0.024ml10%SDS,加入0.002ml蛋白酶K,混勻,65°C環(huán)境中水浴30min;
2.4 然后渦旋1min,加入0.024ml5M NaCl,加入1/10體積的10%CTAB(約0.013ml);2.5 于65°C水浴60min,渦旋1min;
2.6 抽提,加入1/2體積(約0.07mi)的Tris飽和酚及1/2體積(約0.07ml)的氯仿:異戊醇(24:1),混勻;
2.7 于離心機(jī)14000轉(zhuǎn)離心1min,取上清液到另一離心管中;
2.8 重復(fù)步驟2.7 2-3次(視兩相界面雜質(zhì)多少而定)。
2.9 加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)混勻,14000轉(zhuǎn)離心10min,取上清液至另一離心管中;
2.10 后開始沉淀,加入0.045ml NH4Ac,輕柔混勻,冰水中放置30min,加入0.6倍體積的異丙醇,混勻,14000轉(zhuǎn)離心10min,棄上清液;
2.11 用1000ul70%乙醇清洗沉淀,室溫晾干,加0.04ml TE Buffer溶解沉淀。
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